Гетерогении нахҳои мушакҳои скелетии инсон берун аз занҷири вазнини миозин

Ташаккур барои боздид аз nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки версияи охирини браузерро истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, ин сайт аз услубҳо ва JavaScript озод хоҳад буд.
Мушакҳои скелетӣ як бофтаи гетерогенӣ мебошанд, ки асосан аз миофибриллҳо иборатанд, ки дар одамон одатан ба се намуд тақсим мешаванд: як "суст" (навъи 1) ва ду "тез" (навъҳои 2A ва 2X). Аммо, гетерогенӣ байни ва дар дохили намудҳои анъанавии миофибриллҳо ба таври кофӣ фаҳмида нашудааст. Мо ба 1050 ва 1038 миофибриллҳои инфиродӣ аз vastus lateralis инсон, усулҳои транскриптомӣ ва протеомӣ татбиқ кардем. Таҳқиқоти протеомӣ мардонро дар бар мегирифт ва таҳқиқоти транскриптомӣ 10 мард ва 2 занро дар бар мегирифт. Илова бар изоформаҳои занҷири вазнини миозин, мо сафедаҳои метаболикӣ, сафедаҳои рибосомӣ ва сафедаҳои пайвандии ҳуҷайраро ҳамчун манбаъҳои тағйирпазирии бисёрченакаи байнимиофибриллҳо муайян кардем. Ғайр аз ин, сарфи назар аз муайян кардани кластерҳои нахҳои суст ва зуд, маълумоти мо нишон медиҳад, ки нахҳои навъи 2X аз ҷиҳати фенотипӣ аз дигар нахҳои зудкаш фарқ карда намешаванд. Ғайр аз ин, таснифоти занҷири вазнини миозин барои тавсифи фенотипи миофибриллҳо дар миопатияҳои немалинӣ нокифоя аст. Умуман, маълумоти мо гетерогении бисёрченакавии миофиберҳоро нишон медиҳад, ки манбаъҳои тағирёбӣ аз изоформаҳои занҷири вазнини миозин берун мераванд.
Гетерогении ҳуҷайра хусусияти ҷудонашавандаи ҳама системаҳои биологӣ буда, ба ҳуҷайраҳо имкон медиҳад, ки барои қонеъ кардани ниёзҳои гуногуни бофтаҳо ва ҳуҷайраҳо тахассус пайдо кунанд.1 Назари анъанавӣ дар бораи гетерогении нахи мушакҳои скелетӣ ин буд, ки нейронҳои моторӣ намуди нахро дар дохили воҳиди моторӣ муайян мекунанд ва намуди нах (яъне, намуди 1, намуди 2A ва намуди 2X дар одамон) аз рӯи хусусиятҳои изоформаҳои занҷири вазнини миозин (MYH) муайян карда мешавад.2 Ин дар аввал ба ноустувории pH ATPase-и онҳо,3,4 ва баъдтар ба ифодаи молекулавии онҳо аз MYH асос ёфта буд.5 Аммо, бо муайян кардан ва қабули минбаъдаи нахҳои "омехта", ки MYH-ҳои сершуморро бо таносубҳои гуногун якҷоя ифода мекунанд, нахҳои мушакҳои скелетӣ бештар ҳамчун як пайвастагӣ ба назар гирифта мешаванд, на ҳамчун намудҳои алоҳидаи нах.6 Бо вуҷуди ин, ин соҳа то ҳол ба MYH ҳамчун таснифгари асосӣ барои таснифи миофабр такя мекунад, ки ин назар эҳтимолан аз маҳдудиятҳо ва таассубҳои назарраси таҳқиқоти аввали хояндаҳо, ки профилҳои ифодаи MYH ва диапазони намудҳои нах аз онҳое, ки дар одамон фарқ мекунанд, таъсир гирифтааст.2 Вазъият бо он далел боз ҳам мураккабтар мешавад, ки мушакҳои гуногуни скелетии инсон доираи гуногуни намудҳои нахро нишон медиҳанд.7 Мушаки вастус латералис мушаки омехта бо профили ифодаи миёна (ва аз ин рӯ намояндагӣ)-и MYH мебошад.7 Ғайр аз ин, осонии намунагирӣ онро мушаки беҳтарин омӯхташуда дар одамон мегардонад.
Ҳамин тариқ, таҳқиқи беғаразонаи гуногунии нахҳои мушакҳои скелетӣ бо истифода аз абзорҳои пуриқтидори "омикс" муҳим, вале инчунин душвор аст, ки қисман аз сабаби хусусияти бисёрҳуҷайраи нахҳои мушакҳои скелетӣ мебошад. Бо вуҷуди ин, технологияҳои транскриптомика8,9 ва протеомика10 дар солҳои охир аз сабаби пешрафтҳои гуногуни технологӣ дар ҳассосият инқилоберо аз сар гузаронидаанд, ки имкон медиҳад, ки мушакҳои скелетӣ бо ҳалли якнах таҳлил карда шаванд. Дар натиҷа, дар тавсифи гуногунии якнах ва вокуниши онҳо ба ангезаҳои атрофӣ ва пиршавӣ11,12,13,14,15,16,17,18 пешрафти назаррас ба даст омадааст. Муҳим он аст, ки ин пешрафтҳои технологӣ татбиқи клиникӣ доранд, ки имкон медиҳанд, ки номуайянии вобаста ба беморӣ муфассалтар ва дақиқтар тавсиф карда шавад. Масалан, патофизиологияи миопатияи немалинӣ, яке аз маъмултарин бемориҳои меросии мушакҳо (MIM 605355 ва MIM 161800), мураккаб ва печида аст.19,20 Аз ин рӯ, тавсифи беҳтари номуайянии нахҳои мушакҳои скелетӣ метавонад ба пешрафтҳои назаррас дар фаҳмиши мо дар бораи ин беморӣ оварда расонад.
Мо усулҳои таҳлили транскриптомӣ ва протеомикии нахҳои мушакҳои скелетии дастӣ аз намунаҳои биопсияи инсонро таҳия кардем ва онҳоро ба ҳазорҳо нахҳо татбиқ кардем, ки ба мо имкон дод, ки гетерогении ҳуҷайравии нахҳои мушакҳои скелетии инсонро таҳқиқ кунем. Дар рафти ин кор, мо қудрати фенотипкунии транскриптомӣ ва протеомикии нахҳои мушакҳоро нишон додем ва сафедаҳои пайвандии метаболикӣ, рибосомӣ ва ҳуҷайраро ҳамчун манбаъҳои муҳими тағйирпазирии байни нахҳо муайян кардем. Ғайр аз ин, бо истифода аз ин ҷараёни кори протеомӣ, мо аҳамияти клиникии миопатияи нематодҳоро дар нахҳои мушакҳои скелетии ягона тавсиф кардем ва гузариши ҳамоҳангшударо ба сӯи нахҳои ғайриоксидативӣ, новобаста аз намуди нах, ки ба MYH асос ёфтааст, ошкор кардем.
Барои таҳқиқи гетерогении нахҳои мушакҳои скелетии инсон, мо ду ҷараёни кориро таҳия кардем, то таҳлили транскриптом ва протеомҳои нахҳои мушакҳои скелетии ягонаро имконпазир гардонем (Расми 1A ва Расми иловагии 1A). Мо якчанд қадамҳои методологиро, аз нигоҳдории намуна ва нигоҳдории якпорчагии РНК ва сафеда то беҳсозии гузариш барои ҳар як равиш, таҳия ва беҳсозии он кардем. Барои таҳлили транскриптом, ин бо ворид кардани штрих-кодҳои молекулавии мушаххаси намуна дар марҳилаи ибтидоии транскрипсияи баръакс ба даст оварда шуд, ки имкон дод 96 нах барои коркарди самараноки поёноб ҷамъ карда шаванд. Пайдарпайии амиқтар (±1 миллион хониш барои як нах) дар муқоиса бо равишҳои анъанавии якҳуҷайра маълумоти транскриптомро боз ҳам ғанӣ гардонид.21 Барои протеомика, мо градиенти кӯтоҳи хроматографиро (21 дақиқа) дар якҷоягӣ бо гирифтани маълумоти DIA-PASEF дар спектрометри массавии timsTOF истифода бурдем, то умқи протеомро беҳсозӣ кунем ва дар айни замон гузарандагии баландро нигоҳ дорем. 22,23 Барои таҳқиқи гетерогении нахҳои мушакҳои скелетии солим, мо транскриптомҳои 1050 нахи алоҳидаро аз 14 донори калонсоли солим ва протеомҳои 1038 нахро аз 5 донори калонсоли солим тавсиф кардем (Ҷадвали иловагии 1). Дар ин мақола, ин маҷмӯаҳои маълумот мутаносибан ҳамчун транскриптомҳои 1000-нахдор ва протеомҳо номида мешаванд. Усули мо дар маҷмӯъ 27237 транскрипт ва 2983 сафедаро дар таҳлилҳои транскриптомӣ ва протеомӣ бо 1000-нахдор муайян кард (Расми 1A, Маҷмӯаҳои маълумоти иловагӣ 1-2). Пас аз филтр кардани маҷмӯаҳои маълумотҳои транскриптомӣ ва протеомӣ барои зиёда аз 1000 гени ошкоршуда ва 50% арзишҳои эътиборнок барои як нах, таҳлилҳои минбаъдаи биоинформатикӣ мутаносибан барои 925 ва 974 нах дар транскриптом ва протеом гузаронида шуданд. Пас аз филтркунӣ, ба ҳисоби миёна 4257 ± 1557 ген ва 2015 ± 234 сафеда (миёна ± SD) дар як нах бо тағйирпазирии маҳдуди байнифардӣ муайян карда шуданд (Расмҳои иловагӣ 1B-C, Маҷмӯаҳои маълумоти иловагӣ 3-4). Аммо, тағйирпазирии дохили субъект дар байни иштирокчиён бештар возеҳ буд, ки эҳтимолан аз сабаби фарқиятҳо дар ҳосили РНК/сафеда байни нахҳои дарозии гуногун ва масоҳати буриши онҳост. Барои аксари сафедаҳо (>2000), коэффитсиенти тағирёбӣ аз 20% камтар буд (Расми иловагӣ 1D). Ҳарду усул имкон доданд, ки доираи васеи динамикии транскриптҳо ва сафедаҳоро бо имзоҳои хеле ифодашуда, ки барои кашиши мушакҳо муҳиманд (масалан, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) сабт кунанд (Расмҳои иловагӣ 1E-F). Аксари хусусиятҳои муайяншуда байни маҷмӯи додаҳои транскриптомӣ ва протеомӣ умумӣ буданд (Расми иловагии 1G) ва шиддати миёнаи UMI/LFQ-и ин хусусиятҳо бо ҳам хеле хуб алоқаманд буданд (r = 0.52) (Расми иловагии 1H).
Ҷараёни кори транскриптомика ва протеомика (бо BioRender.com сохта шудааст). BD Каҷҳои диапазони динамикӣ барои MYH7, MYH2 ва MYH1 ва остонаҳои ҳисобшуда барои таъини намуди нах. E, F Тақсимоти ифодаи MYH дар байни нахҳо дар маҷмӯаҳои додаҳои транскриптомика ва протеомика. G, H Графикҳои наздикшавӣ ва проексияи якхелаи гуногунрангӣ (UMAP) барои транскриптомика ва протеомика, ки бо намуди нахи асоси MYH ранг карда шудаанд. I, J Графикҳои хусусиятҳое, ки ифодаи MYH7, MYH2 ва MYH1-ро дар маҷмӯаҳои додаҳои транскриптомика ва протеомика нишон медиҳанд.
Мо дар аввал тасмим гирифтем, ки ба ҳар як нах намуди нахи MYH-ро бо истифода аз равиши оптимизатсияшуда таъин кунем, ки аз ҳассосияти баланд ва диапазони динамикии ифодаи MYH дар маҷмӯаҳои додаҳои omics истифода мебарад. Тадқиқотҳои қаблӣ аз остонаҳои худсарона барои нишон додани нахҳо ҳамчун намуди холис 1, намуди 2A, намуди 2X ё омехта дар асоси фоизи муқарраршудаи ифодаи MYH-ҳои гуногун истифода кардаанд11,14,24. Мо равиши дигареро истифода бурдем, ки дар он ифодаи ҳар як нах аз рӯи MYH-ҳое, ки мо барои номбар кардани нахҳо истифода кардем, баҳогузорӣ карда шуд: MYH7, MYH2 ва MYH1, ки мутаносибан ба нахҳои навъи 1, намуди 2A ва навъи 2X мувофиқат мекунанд. Сипас, мо нуқтаи каҷшавии поёнии ҳар як каҷи ҳосилшударо ба таври математикӣ ҳисоб кардем ва онро ҳамчун остона барои таъин кардани нахҳо ҳамчун мусбат (болотар аз остона) ё манфӣ (поёнтар аз остона) барои ҳар як MYH истифода бурдем (Расми 1B-D). Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки MYH7 (Расми 1B) ва MYH2 (Расми 1C) дар сатҳи РНК нисбат ба сатҳи сафеда профилҳои ифодаи фурӯзон/хомӯшкунии равшантар доранд. Дар ҳақиқат, дар сатҳи сафеда, нахҳои хеле кам MYH7-ро ифода намекарданд ва ҳеҷ як нах 100% ифодаи MYH2 надошт. Сипас, мо аз остонаҳои пешакӣ муайяншудаи ифода истифода бурдем, то намудҳои нахи MYH-ро ба ҳамаи нахҳо дар ҳар як маҷмӯи додаҳо таъин кунем. Масалан, нахҳои MYH7+/MYH2-/MYH1- ба намуди 1 таъин карда шуданд, дар ҳоле ки нахҳои MYH7-/MYH2+/MYH1+ ба намуди омехтаи 2A/2X таъин карда шуданд (барои тавсифи пурра ба Ҷадвали иловагии 2 нигаред). Бо якҷоя кардани ҳамаи нахҳо, мо тақсимоти хеле монандро дар байни намудҳои нахи MYH дар сатҳи RNA (Расми 1E) ва сафеда (Расми 1F) мушоҳида кардем, дар ҳоле ки таркиби нисбии намудҳои нахи MYH дар байни афрод, тавре ки интизор мерафт, фарқ мекард (Расми иловагии 2A). Аксари нахҳо ҳамчун намуди холиси 1 (34-35%) ё намуди 2A (36-38%) тасниф карда шуданд, гарчанде ки шумораи зиёди нахҳои омехтаи навъи 2A/2X низ ошкор карда шуданд (16-19%). Фарқияти назаррас дар он аст, ки нахҳои холиси навъи 2X-ро танҳо дар сатҳи РНК муайян кардан мумкин аст, аммо на дар сатҳи сафеда, ки ин нишон медиҳад, ки ифодаи босуръати MYH ҳадди аққал қисман пас аз транскрипсия танзим карда мешавад.
Мо усули типикунонии нахи MYH-и худро, ки дар асоси протеомика аст, бо истифода аз блоттинги нуқтаӣ дар асоси антитело тасдиқ кардем ва ҳарду усул дар муайян кардани нахҳои холиси намуди 1 ва намуди 2A ба мувофиқати 100% ноил шуданд (нигаред ба расми иловагии 2B). Бо вуҷуди ин, равиши дар асоси протеомика ҳассостар, дар муайян кардани нахҳои омехта ва муайян кардани таносуби ҳар як гени MYH дар ҳар як нах самараноктар буд. Ин маълумот самаранокии истифодаи равиши объективӣ ва хеле ҳассос дар асоси омикаро барои тавсифи намудҳои нахҳои мушакҳои скелетӣ нишон медиҳанд.
Сипас, мо аз маълумоти якҷояи транскриптомика ва протеомика истифода бурдем, то миофиберҳоро дар асоси транскриптом ё протеоми пурраи онҳо ба таври объективӣ тасниф кунем. Бо истифода аз усули якхелаи тақриб ва проексияи бисёрҷониба (UMAP) барои кам кардани андозагирӣ то шаш ҷузъи асосӣ (Расми иловагии 3A–B), мо тавонистем тағирёбии миофиберҳоро дар транскриптом (Расми 1G) ва протеом (Расми 1H) тасаввур кунем. Қобили зикр аст, ки миофиберҳо аз рӯи иштирокчиён (Расми иловагии 3C–D) ё рӯзҳои санҷиш (Расми иловагии 3E) дар маҷмӯаҳои додаҳои транскриптомика ё протеомика гурӯҳбандӣ нашудаанд, ки ин нишон медиҳад, ки тағирёбии дохили субъект дар нахҳои мушакҳои скелетӣ нисбат ба тағирёбии байни субъект баландтар аст. Дар графики UMAP, ду кластери алоҳида, ки миофиберҳои "зуд" ва "суст"-ро ифода мекунанд, пайдо шуданд (Расми 1G–H). Миофиберҳои MYH7+ (суст) дар қутби мусбати UMAP1 ҷамъ шуда буданд, дар ҳоле ки миофиберҳои MYH2+ ва MYH1+ (зуд) дар қутби манфии UMAP1 ҷамъ шуда буданд (Расми 1I–J). Аммо, дар асоси ифодаи MYH байни намудҳои нахи зудкаш (яъне, намуди 2A, намуди 2X ё омехтаи 2A/2X) фарқият гузошта нашудааст, ки ин нишон медиҳад, ки ифодаи MYH1 (Расми 1I–J) ё дигар маркерҳои классикии миофиберҳои 2X, ба монанди ACTN3 ё MYLK2 (Расми иловагии 4A–B) ҳангоми баррасии тамоми транскриптом ё протеом байни намудҳои гуногуни миофибер фарқ намекунад. Ғайр аз ин, дар муқоиса бо MYH2 ва MYH7, транскриптҳо ё сафедаҳои кам бо MYH1 коррелятсияи мусбат доштанд (Расми иловагии 4C–H), ки нишон медиҳад, ки фаровонии MYH1 транскриптом/протеоми миофиберро пурра инъикос намекунад. Ҳангоми арзёбии ифодаи омехтаи се изоформаи MYH дар сатҳи UMAP (Расми иловагии 4I–J) ба хулосаҳои монанд расидаанд. Ҳамин тариқ, дар ҳоле ки нахҳои 2X-ро дар сатҳи транскрипт танҳо дар асоси миқдори MYH муайян кардан мумкин аст, нахҳои MYH1+ ҳангоми баррасии тамоми транскриптом ё протеом аз дигар нахҳои зуд фарқ карда намешаванд.
Ҳамчун як таҳқиқоти ибтидоии гетерогении нахи суст берун аз MYH, мо чор сафедаи муқарраршудаи навъи нахи сустро арзёбӣ кардем: TPM3, TNNT1, MYL3 ва ATP2A22. Зернамудҳои нахи суст ҳам дар транскриптомика (Расми иловагии 5A) ва ҳам дар протеомика (Расми иловагии 5B) коррелятсияҳои баланди Пирсонро бо MYH7 нишон доданд, гарчанде ки комил нестанд. Тақрибан 25% ва 33% нахҳои суст мутаносибан аз рӯи ҳамаи зернамудҳои ген/сафеда дар транскриптомика (Расми иловагии 5C) ва протеомика (Расми иловагии 5D) ҳамчун нахҳои сусти холис тасниф нашудаанд. Аз ин рӯ, таснифоти нахи суст дар асоси зернамудҳои сершумори ген/сафеда, ҳатто барои сафедаҳое, ки ба намуди нах хосанд, мураккабии иловагиро ба вуҷуд меорад. Ин нишон медиҳад, ки таснифоти нах дар асоси изоформаҳои як оилаи як ген/сафеда метавонад гетерогении воқеии нахҳои мушакҳои скелетиро ба таври кофӣ инъикос накунад.
Барои омӯзиши минбаъдаи тағйирпазирии фенотипии нахҳои мушакҳои скелетии инсон дар миқёси тамоми модели омикс, мо бо истифода аз таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA) кам кардани беғаразонаи андозагирии маълумотро анҷом додем (Расми 2A). Монанд ба графикҳои UMAP, на иштирокчӣ ва на рӯзи санҷиш ба кластеризатсияи нах дар сатҳи PCA таъсир нарасонданд (Расми иловагии 6A-C). Дар ҳарду маҷмӯи маълумот, намуди нахи MYH аз ҷониби PC2 шарҳ дода шуд, ки кластери нахҳои навъи 1-и сусткашида ва кластери дуюмро, ки дорои нахҳои зудкашидаи навъи 2A, навъи 2X ва нахҳои омехтаи 2A/2X мебошанд, нишон дод (Расми 2A). Дар ҳарду маҷмӯи маълумот, ин ду кластер бо шумораи ками нахҳои омехтаи навъи 1/2A пайваст карда шуданд. Тавре ки интизор мерафт, таҳлили аз ҳад зиёди драйверҳои асосии PC тасдиқ кард, ки PC2 аз ҷониби имзоҳои кашишхӯрӣ ва метаболикӣ идора карда мешавад (Расми 2B ва Расми иловагии 6D-E, Маҷмӯаҳои маълумоти иловагӣ 5-6). Умуман, намуди нахи MYH барои шарҳ додани тағирёбии пайваста дар баробари PC2 кофӣ буд, ба истиснои нахҳои ба ном 2X, ки дар тамоми транскриптом дар дохили кластери зуд паҳн шудаанд.
A. Қиссаҳои таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA)-и маҷмӯаҳои маълумотҳои транскриптом ва протеомҳо, ки мувофиқи намуди нах дар асоси MYH ранг карда шудаанд. B. Таҳлили ғанӣ гардонидани драйверҳои транскрипт ва сафедаҳо дар PC2 ва PC1. Таҳлили оморӣ бо истифода аз бастаи clusterProfiler ва арзишҳои p-и танзимшудаи Benjamini-Hochberg анҷом дода шуд. C, D. Қиссаҳои PCA, ки мувофиқи истилоҳоти онтологияи гени часпакии байниҳуҷайравӣ (GO) дар транскриптом ва истилоҳоти GO-и костамера дар протеом ранг карда шудаанд. Тирҳо драйверҳои транскрипт ва сафеда ва самтҳои онҳоро нишон медиҳанд. E, F. Қиссаҳои хусусиятҳои якхелаи тақрибӣ ва проексияи бисёрфунксионалӣ (UMAP) бо хусусиятҳои аз ҷиҳати клиникӣ муҳим, ки градиентҳои ифодаро новобаста аз намуди нахи суст/тез нишон медиҳанд. G, H. Ҳамбастагӣ байни драйверҳои PC2 ва PC1 дар транскриптомҳо ва протеомҳо.
Ғайричашмдошт, навъи миофибери MYH танҳо дараҷаи дуюми баландтарини тағйирпазириро (PC2) шарҳ дод, ки нишон медиҳад, ки дигар омилҳои биологӣ, ки ба навъи миофибери MYH (PC1) алоқаманд нестанд, дар танзими гетерогении нахи мушакҳои скелетӣ нақши муҳим доранд. Таҳлили аз ҳад зиёди омилҳои асосии PC1 нишон дод, ки тағйирпазирӣ дар PC1 асосан аз рӯи часпиши ҳуҷайра-ҳуҷайра ва миқдори рибосома дар транскриптом ва костамерҳо ва сафедаҳои рибосомӣ дар протеом муайян карда мешавад (Расми 2B ва расмҳои иловагӣ 6D-E, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 7). Дар мушакҳои скелетӣ, костамерҳо диски Z-ро ба сарколемма пайваст мекунанд ва дар интиқоли қувва ва сигнализатсия иштирок мекунанд. 25 Графикҳои PCA-и шарҳдодашуда бо истифода аз хусусиятҳои часпиши ҳуҷайра-ҳуҷайра (транскриптом, Расми 2C) ва костамер (протеом, Расми 2D), ҳаракати қавии чапро дар PC1 нишон доданд, ки нишон медиҳад, ки ин хусусиятҳо дар баъзе нахҳо ғанӣ шудаанд.
Таҳқиқоти муфассалтари кластеризатсияи миофиберҳо дар сатҳи UMAP нишон дод, ки аксари хусусиятҳо градиенти ифодаи MYH-ро, ки аз навъи миофибер вобаста нест, на ба зеркластерҳои хоси миофибер нишон доданд. Ин пайвастагӣ барои якчанд генҳои марбут ба ҳолатҳои патологӣ (Расми 2E), ба монанди CHCHD10 (бемории асаб-мушакӣ), SLIT3 (атрофияи мушакҳо), CTDNEP1 (бемории мушакҳо) мушоҳида карда шуд. Ин пайвастагӣ инчунин дар саросари протеом, аз ҷумла сафедаҳои марбут ба ихтилоли асаб (UGDH), сигнализатсияи инсулин (PHIP) ва транскрипсия (HIST1H2AB) мушоҳида карда шуд (Расми 2F). Дар маҷмӯъ, ин маълумотҳо пайвастагии гетерогении суст/тези печишро, ки аз навъи нах вобаста нест, дар байни миофиберҳои гуногун нишон медиҳанд.
Ҷолиб он аст, ки генҳои драйвер дар PC2 коррелятсияи хуби транскриптом-протеомро нишон доданд (r = 0.663) (Расми 2G), ки нишон медиҳад, ки намудҳои нахҳои суст ва зудкашида, бахусус хосиятҳои кашишхӯрӣ ва метаболитикии нахҳои мушакҳои скелетӣ, аз ҷиҳати транскрипсия танзим карда мешаванд. Аммо, генҳои драйвер дар PC1 коррелятсияи транскриптом-протеомро нишон надоданд (r = -0.027) (Расми 2H), ки нишон медиҳад, ки тағйироте, ки ба намудҳои нахҳои суст/тезкашида алоқаманд нестанд, пас аз транскрипсия асосан танзим карда мешаванд. Азбаски тағйиротҳо дар PC1 асосан бо истилоҳоти онтологияи генҳои рибосомӣ шарҳ дода мешуданд ва бо назардошти он, ки рибосомаҳо бо иштироки фаъолона дар тарҷумаи сафеда ва таъсир расонидан ба он нақши муҳим ва махсус дар ҳуҷайра мебозанд,31, мо минбаъд ба таҳқиқи ин гетерогении ғайричашмдошти рибосомӣ шурӯъ мекунем.
Мо аввал графики таҳлили ҷузъҳои асосии протеомикаро мувофиқи фаровонии нисбии сафедаҳо дар истилоҳи GOCC "рибосомаи ситоплазмӣ" ранг кардем (Расми 3A). Гарчанде ки ин истилоҳ аз тарафи мусбати PC1 ғанӣ гардонида шудааст, ки боиси градиенти хурд мегардад, сафедаҳои рибосомӣ тақсимшавиро дар ҳарду самти PC1 ба вуҷуд меоранд (Расми 3A). Сафедаҳои рибосомӣ, ки аз тарафи манфии PC1 ғанӣ гардонида шудаанд, RPL18, RPS18 ва RPS13-ро дар бар мегирифтанд (Расми 3B), дар ҳоле ки RPL31, RPL35 ва RPL38 (Расми 3C) омилҳои асосии тарафи мусбати PC1 буданд. Ҷолиб он аст, ки RPL38 ва RPS13 дар мушакҳои скелетӣ дар муқоиса бо дигар бофтаҳо хеле ифода ёфтаанд (Расми иловагӣ 7A). Ин имзоҳои фарқкунандаи рибосомӣ дар PC1 дар транскриптом мушоҳида нашуданд (Расми иловагӣ 7B), ки танзими пас аз транскрипсияро нишон медиҳад.
A. Нақшаи таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA) мувофиқи истилоҳоти онтологияи генҳои ситоплазмавӣ (GO) дар саросари протеом ранг карда шудааст. Тирҳо самти тағирёбии тавассути сафеда ба вуҷуд омадаро дар нақшаи PCA нишон медиҳанд. Дарозии хат ба холҳои ҷузъҳои асосӣ барои сафедаи додашуда мувофиқат мекунад. B, C. PCA нақшаҳои RPS13 ва RPL38-ро дар бар мегирад. D. Таҳлили кластерии иерархии беназорати сафедаҳои ситоплазмавии рибосомавӣ. E. Модели сохтории рибосомаи 80S (PDB: 4V6X), ки сафедаҳои рибосомаро бо миқдори гуногун дар нахҳои мушакҳои скелетӣ нишон медиҳад. F. Сафедаҳои рибосомавӣ бо стехиометрияи гуногун, ки дар наздикии канали баромади mRNA ҷойгир шудаанд.
Қаблан мафҳумҳои гетерогенӣ ва тахассуси рибосомӣ пешниҳод шуда буданд, ки дар он мавҷудияти зерпопулятсияҳои гуногуни рибосома (гетерогении рибосомаҳо) метавонад мустақиман ба тарҷумаи сафедаҳо дар бофтаҳои гуногун32 ва ҳуҷайраҳо33 тавассути тарҷумаи интихобии ҳавзҳои транскрипти мушаххаси mRNA34 (тахассуси рибосомаҳо) таъсир расонад. Барои муайян кардани зерпопулятсияҳои сафедаҳои рибосомаҳо, ки дар нахҳои мушакҳои скелетӣ якҷоя ифода ёфтаанд, мо таҳлили кластерии иерархии беназорати сафедаҳои рибосомаро дар протеома анҷом додем (Расми 3D, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 8). Тавре ки интизор мерафт, сафедаҳои рибосомаҳо аз рӯи намуди нах дар асоси MYH кластер нашуданд. Бо вуҷуди ин, мо се кластери алоҳидаи сафедаҳои рибосомаро муайян кардем; кластери аввал (ribosomal_cluster_1) бо RPL38 ҳамоҳанг карда мешавад ва аз ин рӯ, ифодаи он дар нахҳо бо профили мусбати PC1 афзоиш ёфтааст. Кластери дуюм (ribosomal_cluster_2) бо RPS13 ҳамоҳанг карда мешавад ва дар нахҳо бо профили манфии PC1 баланд мешавад. Кластер сеюм (ribosomal_cluster_3) ифодаи дифференсиалии ҳамоҳангшударо дар нахҳои мушакҳои скелетӣ нишон намедиҳад ва онро метавон сафедаи рибосомавии "аслӣ"-и мушакҳои скелетӣ ҳисобид. Ҳарду кластерҳои рибосомавии 1 ва 2 дорои сафедаҳои рибосомавӣ мебошанд, ки қаблан нишон дода шуда буданд, ки тарҷумаи алтернативиро танзим мекунанд (масалан, RPL10A, RPL38, RPS19 ва RPS25) ва ба рушд таъсир мерасонанд (масалан, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Мутобиқи натиҷаҳои PCA, намояндагии гетерогении мушоҳидашудаи ин сафедаҳои рибосомавӣ дар саросари нахҳо низ пайвастагиро нишон дод (Расми иловагӣ 7C).
Барои тасаввур кардани ҷойгиршавии сафедаҳои рибосомавии гетерогенӣ дар дохили рибосома, мо аз модели сохтории рибосомаи 80S-и инсонӣ (Бонки додаҳои сафедаҳо: 4V6X) истифода кардем (Расми 3E). Пас аз ҷудо кардани сафедаҳои рибосомавии ба кластерҳои гуногуни рибосомавӣ тааллуқдошта, ҷойгиршавии онҳо ба ҳам наздик набуд, ки ин нишон медиҳад, ки равиши мо барои минтақаҳо/фракцияҳои муайяни рибосома ғанӣ гардонида натавонист. Аммо, ҷолиб он аст, ки таносуби сафедаҳои зерқисмати калон дар кластери 2 нисбат ба кластерҳои 1 ва 3 камтар буд (Расми иловагӣ 7D). Мо мушоҳида кардем, ки сафедаҳо бо стехиометрияи тағйирёфта дар нахҳои мушакҳои скелетӣ асосан дар сатҳи рибосома ҷойгир шудаанд (Расми 3E), ки бо қобилияти онҳо барои ҳамкорӣ бо унсурҳои макони вуруди дохилии рибосома (IRES) дар популятсияҳои гуногуни mRNA мувофиқ аст ва бо ин васила тарҷумаи интихобӣ ҳамоҳанг карда мешавад.40,41 Ғайр аз ин, бисёр сафедаҳо бо стехиометрияи тағйирёфта дар нахҳои мушакҳои скелетӣ дар наздикии минтақаҳои функсионалӣ, ба монанди нақби баромади mRNA (Расми 3F), ҷойгир буданд, ки дарозшавии тарҷумавӣ ва боздошти пептидҳои мушаххасро интихобан танзим мекунанд. 42 Хулоса, маълумоти мо нишон медиҳанд, ки стехиометрияи сафедаҳои рибосомавии мушакҳои скелетӣ гетерогенӣ нишон медиҳад, ки боиси фарқиятҳо байни нахҳои мушакҳои скелетӣ мегардад.
Баъдан, мо ба муайян кардани имзоҳои нахи зуд ва сусткашида ва омӯхтани механизмҳои танзими транскрипсияи онҳо шурӯъ кардем. Бо муқоисаи кластерҳои нахи зуд ва сусткашида, ки аз ҷониби UMAP дар ду маҷмӯи додаҳо муайян шудаанд (Расмҳои 1G-H ва 4A-B), таҳлилҳои транскриптомӣ ва протеомӣ мутаносибан 1366 ва 804 хусусиятҳои фаровони гуногунро муайян карданд (Расмҳои 4A-B, Маҷмӯаҳои маълумоти иловагӣ 9-12). Мо фарқиятҳои интизоршударо дар имзоҳои марбут ба саркомерҳо (масалан, тропомиозин ва тропонин), пайвастшавии ангезиш-кашиш (изоформаҳои SERCA) ва мубодилаи энергия (масалан, ALDOA ва CKB) мушоҳида кардем. Ғайр аз ин, транскриптҳо ва сафедаҳое, ки убиквитинатсияи сафедаҳоро танзим мекунанд, дар нахҳои зуд ва сусткашида ба таври гуногун ифода карда шуданд (масалан, USP54, SH3RF2, USP28 ва USP48) (Расмҳои 4A-B). Ғайр аз ин, гени сафедаи микробӣ RP11-451G4.2 (DWORF), ки қаблан нишон дода шуда буд, ки дар байни намудҳои нахи мушакҳои барра43 ба таври гуногун ифода мешавад ва фаъолияти SERCA-ро дар мушакҳои дил44 афзоиш медиҳад, дар нахҳои мушакҳои сусти скелетӣ ба таври назаррас баландтар шудааст (Расми 4A). Ба ҳамин монанд, дар сатҳи нахи инфиродӣ, фарқиятҳои назаррас дар имзоҳои маълум, ба монанди изоформаҳои лактатдегидрогеназаи марбут ба мубодилаи моддаҳо (LDHA ва LDHB, Расми 4C ва Расми иловагӣ 8A)45,46, инчунин имзоҳои қаблан номаълуми мушаххаси навъи нах (ба монанди IRX3, USP54, USP28 ва DPYSL3) мушоҳида шуданд (Расми 4C). Байни маҷмӯи додаҳои транскриптомӣ ва протеомӣ ҳампӯшии назарраси хусусиятҳои гуногунранг ифодашуда мушоҳида шуд (Расми иловагӣ 8B), инчунин коррелятсияи тағйири қат, ки асосан аз ҷониби ифодаи фарқкунандаи хусусиятҳои саркомерӣ возеҳтар ба вуҷуд омадааст (Расми иловагӣ 8C). Қобили зикр аст, ки баъзе имзоҳо (масалан, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) танзими қавии пас аз транскрипсияро танҳо дар сатҳи протеомӣ нишон доданд ва профилҳои ифодаи хоси навъи нахи суст/тезро доштанд (Расми иловагӣ 8C).
Графикҳои вулқонии А ва В, ки кластерҳои суст ва зудро, ки тавассути графикҳои якхелаи тақрибӣ ва проексияи бисёрҷониба (UMAP) дар расмҳои 1G-H муайян карда шудаанд, муқоиса мекунанд. Нуқтаҳои ранга транскриптҳо ё сафедаҳоеро нишон медиҳанд, ки дар FDR <0.05 ба таври назаррас фарқ мекунанд ва нуқтаҳои ториктар транскриптҳо ё сафедаҳоеро нишон медиҳанд, ки дар тағйири логарифм > 1 ба таври назаррас фарқ мекунанд. Таҳлили омории дуҷониба бо истифода аз санҷиши DESeq2 Wald бо арзишҳои p-и танзимшудаи Benjamini-Hochberg (транскриптомика) ё усули модели хаттии Лимма бо таҳлили эмпирикии Байес ва баъдан танзими Benjamini-Hochberg барои муқоисаҳои сершумор (протеомика) анҷом дода шуд. C Графикҳои имзоии генҳо ё сафедаҳои интихобшудаи бо дифференсиалӣ ифодашуда байни нахҳои суст ва зуд. D Таҳлили ғанӣ гардонидани транскриптҳо ва сафедаҳои бо дифференсиалӣ ифодашуда. Арзишҳои такроршаванда дар ҳарду маҷмӯи додаҳо ғанӣ гардонида шудаанд, арзишҳои транскриптом танҳо дар транскриптом ва арзишҳои протеом танҳо дар протеом ғанӣ гардонида шудаанд. Таҳлили оморӣ бо истифода аз бастаи clusterProfiler бо арзишҳои p-и танзимшудаи Benjamini-Hochberg анҷом дода шуд. E. Омилҳои транскрипсияи навъи нах, ки аз ҷониби SCENIC дар асоси холҳои хосияти танзимгари аз SCENIC гирифташуда ва ифодаи дифференсиалии mRNA байни намудҳои нах муайян карда шудаанд. F. Профили омилҳои интихобшудаи транскрипсия, ки байни нахҳои суст ва зуд ба таври гуногун ифода ёфтаанд.
Сипас мо таҳлили аз ҳад зиёди намояндагии генҳо ва сафедаҳои гуногунҷабҳаро анҷом додем (Расми 4D, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 13). Ғанигардонии роҳ барои хусусиятҳое, ки байни ду маҷмӯи маълумот фарқ мекарданд, фарқиятҳои интизоршударо, ба монанди оксидшавии β-кислотаи равғанӣ ва равандҳои мубодилаи кетонҳо (нахҳои суст), кашиши миофиламент/мушакҳо (мутаносибан нахҳои зуд ва суст) ва равандҳои катаболии карбогидратҳо (нахҳои зуд), нишон дод. Фаъолияти фосфатазаи сафедаи серин/треонин низ дар нахҳои зуд баланд шуд, ки аз ҷониби хусусиятҳо ба монанди зерқисматҳои фосфатазаи танзимкунанда ва каталитикӣ (PPP3CB, PPP1R3D ва PPP1R3A), ки маълум аст, ки мубодилаи гликогенро танзим мекунанд (47) (Расми иловагии 8D-E). Роҳҳои дигаре, ки аз нахҳои зуд бой шудаанд, иборатанд аз ҷисмҳои коркардкунанда (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) дар протеом (Расми иловагии 8F), ки эҳтимолан дар танзими пас аз транскрипсия иштирок мекунанд (48) ва фаъолияти омили транскрипсия (SREBF1, RXRG, RORA) дар транскриптом (Расми иловагии 8G). Нахҳои суст аз фаъолияти оксидоредуктаза (BDH1, DCXR, TXN2) (Расми иловагии 8H), пайвастшавии амид (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Расми иловагии 8I), матритсаи берун аз ҳуҷайра (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Расми иловагии 8J) ва фаъолияти ретсептор-лиганд (FNDC5, SPX, NENF) (Расми иловагии 8K).
Барои фаҳмиши бештар дар бораи танзими транскрипсия, ки дар асоси хусусиятҳои навъи нахи мушакҳои суст/тез аст, мо таҳлили ғанӣ гардонидани омили транскрипсияро бо истифода аз SCENIC49 (Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 14) анҷом додем. Бисёре аз омилҳои транскрипсия байни нахҳои мушакҳои зуд ва суст ба таври назаррас ғанӣ гардонида шуданд (Расми 4E). Ин омилҳои транскрипсияро ба монанди MAFA, ки қаблан бо рушди босуръати нахи мушакҳо алоқаманд буд,50, инчунин якчанд омилҳои транскрипсияро, ки қаблан бо барномаҳои гении мушаххаси навъи нахи мушакҳо алоқаманд набуданд, дар бар мегирифт. Дар байни инҳо, PITX1, EGR1 ва MYF6 омилҳои транскрипсияи ғанӣтарин дар нахҳои мушакҳои зуд буданд (Расми 4E). Баръакс, ZSCAN30 ва EPAS1 (инчунин бо номи HIF2A маълум аст) омилҳои транскрипсияи ғанӣтарин дар нахҳои мушакҳои суст буданд (Расми 4E). Мувофиқи ин, MAFA дар сатҳҳои баландтар дар минтақаи UMAP, ки ба нахҳои мушакҳои зуд мувофиқат мекунад, ифода мешуд, дар ҳоле ки EPAS1 намунаи ифодаи муқобил дошт (Расми 4F).
Илова бар генҳои маъруфи рамзгузории сафедаҳо, биотипҳои сершумори РНК-и ғайрирамзгузор мавҷуданд, ки метавонанд дар танзими рушд ва бемории инсон иштирок кунанд. 51, 52 Дар маҷмӯаҳои додаҳои транскриптомӣ, якчанд РНК-ҳои ғайрирамзгузор хосияти навъи нахро нишон медиҳанд (Расми 5A ва Маҷмӯаи додаҳои иловагӣ 15), аз ҷумла LINC01405, ки барои нахҳои суст хеле хос аст ва гузориш дода мешавад, ки дар мушакҳо аз беморони гирифтори миопатияи митохондрия коҳиш ёфтааст. 53 Баръакс, RP11-255P5.3, ки ба гени lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 мувофиқат мекунад, хосияти навъи нахи зудро нишон медиҳад. Ҳам LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) ва ҳам RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) хосияти мушакҳои скелетӣ доранд (Расмҳои иловагии 9A–B) ва дар дохили маҳаллаи геномии 1 Мб генҳои маълуми кашишхӯрӣ надоранд, ки ин нишон медиҳад, ки онҳо дар танзими намудҳои нахҳо нақши махсус доранд, на танзими генҳои кашишхӯрии ҳамсоя. Профилҳои ифодаи навъи нахи суст/суръати LINC01405 ва RP11-255P5.3 мутаносибан бо истифода аз RNAscope тасдиқ карда шуданд (Расмҳои 5B–C).
A. Транскриптҳои РНК-и ғайрирамзӣ дар нахҳои мушакҳои суст ва зудкашида ба таври назаррас танзим карда мешаванд. B. Тасвирҳои намояндагии РНКоскоп, ки хусусияти навъи нахҳои суст ва зудкашидаи LINC01405 ва RP11-255P5.3-ро мутаносибан нишон медиҳанд. Миқёси сатр = 50 мкм. C. Миқдори ифодаи РНК-и ғайрирамзӣ ба навъи миофибер, ки бо RNAscope муайян карда мешавад (n = 3 биопсия аз шахсони мустақил, муқоисаи нахҳои мушакҳои зуд ва суст дар дохили ҳар як шахс). Таҳлили оморӣ бо истифода аз санҷиши дуҷонибаи t-и Студент анҷом дода шуд. Графикҳои қуттӣ медиана ва квартилҳои якум ва сеюмро нишон медиҳанд, ки мӯйлабҳо ба арзишҳои ҳадди ақал ва ҳадди аксар ишора мекунанд. D. Ҷараёни кори муайянкунии сафедаҳои микробҳои De novo (бо BioRender.com сохта шудааст). E. Сафедаи микробӣ LINC01405_ORF408:17441:17358 махсусан дар нахҳои сусти мушакҳои скелетӣ ифода меёбад (n=5 биопсия аз иштирокчиёни мустақил, ки нахҳои мушакҳои зуд ва сустро дар ҳар як иштирокчӣ муқоиса мекунанд). Таҳлили оморӣ бо истифода аз усули модели хаттии Лимм дар якҷоягӣ бо равиши эмпирикии Байес анҷом дода шуд ва баъдан усули Бенҷамини-Ҳохберг барои муқоисаҳои сершумор бо танзими арзиши p истифода шуд. Диаграммаҳои қуттӣ медиана, квартилҳои якум ва сеюмро нишон медиҳанд, ки мӯйлабҳо ба арзишҳои ҳадди аксар/ҳадди ақал ишора мекунанд.
Ба наздикӣ, таҳқиқот нишон доданд, ки бисёр транскриптҳои ғайрирамзгузоришаванда сафедаҳои микробҳои транскрипсияшударо рамзгузорӣ мекунанд, ки баъзеи онҳо фаъолияти мушакҳоро танзим мекунанд. 44, 55 Барои муайян кардани сафедаҳои микробӣ бо хосияти эҳтимолии навъи нах, мо маҷмӯи додаҳои протеоми нахи 1000-и худро бо истифода аз файли фармоишии FASTA, ки пайдарпайии транскриптҳои ғайрирамзгузориро (n = 305) дар маҷмӯи додаҳои транскриптомҳои нахи 1000 пайдо кардааст, ҷустуҷӯ кардем (Расми 5D). Мо 197 сафедаи микробӣ аз 22 транскрипти гуногунро муайян кардем, ки 71-тои онҳо байни нахҳои мушакҳои скелетии суст ва зуд ба таври гуногун танзим карда шуданд (Расми иловагии 9C ва Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 16). Барои LINC01405, се маҳсулоти сафедаи микробӣ муайян карда шуданд, ки яке аз онҳо хосияти сусти нахро ба транскрипти худ нишон дод (Расми 5E ва Расми иловагии 9D). Ҳамин тариқ, мо LINC01405-ро ҳамчун ген муайян кардем, ки сафедаи микробӣ, ки барои нахҳои мушакҳои скелетии суст хос аст, рамзгузорӣ мекунад.
Мо ҷараёни кори ҳамаҷонибаро барои тавсифи протеомикии миқёси калони нахҳои мушакҳои алоҳида таҳия кардем ва танзимгарони гетерогении нахҳоро дар ҳолатҳои солим муайян кардем. Мо ин ҷараёни кориро барои фаҳмидани он, ки чӣ гуна миопатияҳои немалинӣ ба гетерогении нахҳои мушакҳои скелетӣ таъсир мерасонанд, истифода бурдем. Миопатияҳои немалинӣ бемориҳои ирсии мушакҳо мебошанд, ки боиси заъфи мушакҳо мешаванд ва дар кӯдакони гирифтор бо як қатор мушкилот, аз ҷумла норасоии нафаскашӣ, сколиоз ва ҳаракати маҳдуди дасту пойҳо зоҳир мешаванд. 19,20 Одатан, дар миопатияҳои немалинӣ, вариантҳои патогенӣ дар генҳо ба монанди актин алфа 1 (ACTA1) боиси бартарии таркиби миофабри нахҳои сусткашида мешаванд, гарчанде ки ин таъсир гетерогенӣ аст. Як истиснои назаррас миопатияи немалинии тропонин T1 (TNNT1) мебошад, ки бартарии нахҳои зудро дорад. Ҳамин тариқ, фаҳмиши беҳтари гетерогении асоси вайроншавии нахҳои мушакҳои скелетӣ, ки дар миопатияҳои немалинӣ мушоҳида мешавад, метавонад барои кушодани робитаи мураккаби байни ин бемориҳо ва намуди миофабри кӯмак кунад.
Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратии солим (n=3 дар як гурӯҳ), миофиберҳое, ки аз беморони гирифтори миопатияи немалинӣ бо мутатсияҳо дар генҳои ACTA1 ва TNNT1 ҷудо карда шуда буданд, атрофияи назаррас ё дистрофияи миофиберҳоро нишон доданд (Расми 6A, Ҷадвали иловагии 3). Ин бо сабаби маҳдуд будани миқдори маводи дастрас барои таҳлили протеомӣ мушкилоти назарраси техникӣ ба бор овард. Бо вуҷуди ин, мо тавонистем 2485 сафедаро дар 272 миофибери скелетӣ муайян кунем. Пас аз филтр кардан барои ҳадди аққал 1000 сафедаи миқдорӣ барои як нах, 250 нах ба таҳлили минбаъдаи биоинформатикӣ дучор карда шуданд. Пас аз филтр кардан, ба ҳисоби миёна 1573 ± 359 сафеда барои як нах миқдорӣ муайян карда шуд (Расми иловагии 10A, Маҷмӯаҳои маълумоти иловагӣ 17-18). Қобили зикр аст, ки сарфи назар аз коҳиши назарраси андозаи нах, чуқурии протеоми намунаҳои беморони миопатияи немалин танҳо каме коҳиш ёфт. Ғайр аз ин, коркарди ин маълумот бо истифода аз файлҳои FASTA-и худамон (аз ҷумла транскриптҳои ғайрирамзгузорӣ) ба мо имкон дод, ки панҷ сафедаи микробҳоро дар миофибҳои скелетӣ аз беморони гирифтори миопатияи немалин муайян кунем (Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 19). Диапазони динамикии протеом ба таври назаррас васеътар буд ва сафедаҳои умумӣ дар гурӯҳи назорат бо натиҷаҳои таҳлили қаблии протеоми 1000-нахӣ хуб коррелятсия мекарданд (Расми иловагӣ 10B-C).
A. Тасвирҳои микроскопӣ, ки атрофияи нах ё дистрофия ва бартарии намудҳои гуногуни нахро дар асоси MYH дар миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1 (NM) нишон медиҳанд. Миқёси сатр = 100 мкм. Барои таъмини такроршавандагии рангкунӣ дар беморони ACTA1 ва TNNT1, се биопсияи бемор ду то се маротиба (чор қисм дар як ҳолат) пеш аз интихоби тасвирҳои намояндагӣ ранг карда шуданд. B. Таносуби намуди нах дар иштирокчиён дар асоси MYH. C. Нақшаи таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA)-и нахҳои мушакҳои скелетӣ дар беморони гирифтори миопатияҳои немалинӣ ва назорат. D. Нахҳои мушакҳои скелетӣ аз беморони гирифтори миопатияҳои немалинӣ ва назоратӣ ба нақшаи PCA, ки аз 1000 нахи таҳлилшуда дар расми 2 муайян карда шудааст, тарҳрезӣ шудаанд. Масалан, нақшаҳои вулқонӣ, ки фарқиятҳоро байни иштирокчиён бо миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1 ва байни иштирокчиён бо миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1 муқоиса мекунанд. Доираҳои ранга сафедаҳоеро нишон медиҳанд, ки дар π < 0.05 ба таври назаррас фарқ мекарданд ва нуқтаҳои торик сафедаҳоеро нишон медиҳанд, ки дар FDR < 0.05 ба таври назаррас фарқ мекарданд. Таҳлили оморӣ бо истифода аз усули модели хаттии Лимма ва усулҳои эмпирикии Байес анҷом дода шуд ва баъдан барои муқоисаҳои сершумор бо истифода аз усули Бенҷамини-Ҳохберг танзими арзиши p анҷом дода шуд. H. Таҳлили ғанӣ гардонидани сафедаҳои ба таври назаррас фарқкунанда дар тамоми протеом ва дар нахҳои навъи 1 ва 2A ифодаёфта. Таҳлили оморӣ бо истифода аз бастаи clusterProfiler ва арзишҳои p-и танзимшудаи Бенҷамини-Ҳохберг анҷом дода шуд. I, J. Қитъаҳои таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA), ки бо истилоҳоти матритсаи берун аз ҳуҷайра ва онтологияи генҳои митохондрия (GO) ранг карда шудаанд.
Азбаски миопатияҳои немалинӣ метавонанд ба таносуби намудҳои миофиберҳои MYH-и ифодакунанда дар мушакҳои скелетӣ таъсир расонанд,19,20 мо аввал намудҳои миофиберҳои MYH-и ифодакунандаро дар беморони гирифтори миопатияҳои немалинӣ ва гурӯҳи назоратӣ таҳқиқ кардем. Мо намуди миофиберро бо истифода аз усули бетарафонае, ки қаблан барои санҷиши 1000 миофибер тавсиф шуда буд, муайян кардем (Расми иловагии 10D-E) ва бори дигар миофиберҳои холиси 2X-ро муайян карда натавонистем (Расми 6B). Мо таъсири гетерогении миопатияҳои немалиниро ба намуди миофибер мушоҳида кардем, зеро ду бемори гирифтори мутатсияҳои ACTA1 таносуби миофиберҳои навъи 1-ро афзоиш доданд, дар ҳоле ки ду бемори гирифтори миопатияи немалинии TNNT1 таносуби миофиберҳои навъи 1-ро коҳиш доданд (Расми 6B). Дар ҳақиқат, ифодаи изоформаҳои MYH2 ва тропонини зуд (TNNC2, TNNI2 ва TNNT3) дар миопатияҳои ACTA1-немалин коҳиш ёфт, дар ҳоле ки ифодаи MYH7 дар миопатияҳои TNNT1-немалин коҳиш ёфт (Расми иловагӣ 11A). Ин бо гузоришҳои қаблӣ дар бораи иваз кардани навъи миофиберҳои гетерогенӣ дар миопатияҳои немалин мувофиқ аст.19,20 Мо ин натиҷаҳоро тавассути иммуногистохимия тасдиқ кардем ва муайян кардем, ки беморони гирифтори миопатияи ACTA1-немалин бартарии миофиберҳои навъи 1 доштанд, дар ҳоле ки беморони гирифтори миопатияи TNNT1-немалин намунаи баръакс доштанд (Расми 6A).
Дар сатҳи протеоми якнахӣ, нахҳои мушакҳои скелетӣ аз беморони гирифтори миопатияи немалинии ACTA1 ва TNNT1 бо аксарияти нахҳои назоратӣ муттаҳид шуданд, ки нахҳои миопатияи немалинии TNNT1 одатан аз ҳама бештар осеб дидаанд (Расми 6C). Ин махсусан ҳангоми тартиб додани нақшаҳои таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA)-и нахҳои псевдо-инфлятсияшуда барои ҳар як бемор равшан буд, ки беморони миопатияи немалинии TNNT1 2 ва 3 аз намунаҳои назоратӣ дуртарин ба назар мерасиданд (Расми иловагии 11B, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 20). Барои беҳтар фаҳмидани он, ки чӣ гуна нахҳои беморони миопатия бо нахҳои солим муқоиса мешаванд, мо маълумоти муфассалеро истифода бурдем, ки аз таҳлили протеомикии 1000 нах аз иштирокчиёни калонсоли солим ба даст оварда шудаанд. Мо нахҳоро аз маҷмӯи маълумотҳои миопатия (беморон ва гурӯҳи назоратӣ) ба нақшаи PCA, ки аз таҳлили протеомикии 1000 нах гирифта шудааст, тарҳрезӣ кардем (Расми 6D). Тақсимоти намудҳои нахи MYH дар PC2 дар нахҳои назоратӣ ба тақсимоти нах, ки аз таҳлили протеомикии 1000-нах ба даст оварда шудааст, монанд буд. Бо вуҷуди ин, аксари нахҳо дар беморони гирифтори миопатияи немалинӣ ба поён PC2 ҳаракат карданд ва бо нахҳои солим ва зудкашида, новобаста аз намуди нахи MYH-и аслии онҳо, ҳампӯшӣ карданд. Ҳамин тариқ, гарчанде ки беморони гирифтори миопатияи немалинии ACTA1 ҳангоми ченкунӣ бо истифода аз усулҳои MYH гузаришро ба сӯи нахҳои навъи 1 нишон доданд, ҳам миопатияи немалинии ACTA1 ва ҳам миопатияи немалинии TNNT1 протеоми нахи мушакҳои скелетиро ба сӯи нахҳои зудкашида интиқол доданд.
Сипас, мо ҳар як гурӯҳи беморонро бо гурӯҳи назоратии солим мустақиман муқоиса кардем ва мутаносибан 256 ва 552 сафедаҳои гуногун ифодаёфтаро дар миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1 муайян кардем (Расми 6E-G ва Расми иловагӣ 11C, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 21). Таҳлили ғанӣ гардонидани ген коҳиши ҳамоҳангшудаи сафедаҳои митохондрияро нишон дод (Расми 6H-I, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 22). Тааҷҷубовар аст, ки сарфи назар аз бартарии гуногуни намудҳои нах дар миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1, ин коҳиш комилан аз намуди нахи дар асоси MYH мустақил буд (Расми 6H ва Расми иловагӣ 11D-I, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 23). Се сафедаи микробӣ низ дар миопатияҳои немалинии ACTA1 ё TNNT1 танзим карда шуданд. Дуто аз ин микропротеинҳо, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (инчунин бо номи LINC00598 ё Lnc-FOXO1 маълуманд) ва ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), танҳо дар миофиберҳои навъи 1 фаровонии гуногун нишон доданд. Қаблан гузориш шуда буд, ки ENSG00000215483_TR14_ORF67 дар танзими давраи ҳуҷайра нақш мебозад. 56 Аз тарафи дигар, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (мувофиқ ба LINC01798) дар миофиберҳои навъи 1 ва навъи 2A дар миопатияи ACTA1-немалин дар муқоиса бо гурӯҳи назоратии солим афзоиш ёфтааст (Расми иловагӣ 12A, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 24). Баръакс, сафедаҳои рибосомӣ аз миопатияи немалинӣ асосан таъсир надоштанд, гарчанде ки RPS17 дар миопатияи немалинии ACTA1 пасттар танзим карда шуд (Расми 6E).
Таҳлили ғанӣгардонӣ инчунин афзоиши танзими равандҳои системаи масуниятро дар миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1 нишон дод, дар ҳоле ки часпиши ҳуҷайраҳо дар миопатияи немалинии TNNT1 низ афзоиш ёфтааст (Расми 6H). Ғанигардонии ин омилҳои берун азҳуҷайравӣ бо сафедаҳои матритсаи берун азҳуҷайравӣ, ки PCA-ро дар PC1 ва PC2 ба самти манфӣ (яъне ба сӯи нахҳои аз ҳама бештар зарардида) интиқол медиҳанд, инъикос ёфтааст (Расми 6J). Ҳарду гурӯҳи беморон ифодаи афзоиши сафедаҳои берун азҳуҷайравиро нишон доданд, ки дар вокунишҳои иммунӣ ва механизмҳои таъмири сарколемма, ба монанди аннексинҳо (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ва сафедаи мутақобилаи онҳо S100A1159 иштирок мекунанд (Расми иловагӣ 12B-C). Қаблан гузориш дода шуда буд, ки ин раванд дар дистрофияҳои мушакҳо60 тақвият ёфтааст, аммо, то он даме ки мо медонем, қаблан бо миопатияҳои немалинӣ алоқаманд набуд. Фаъолияти муқаррарии ин механизми молекулавӣ барои таъмири сарколемма пас аз осеб ва барои омезиши миоситҳои навтаъсис бо миофибрҳо58,61 зарур аст. Ҳамин тариқ, афзоиши фаъолияти ин раванд дар ҳарду гурӯҳи беморон аз вокуниши барқароркунанда ба осебе, ки аз ноустувории миофибер ба вуҷуд омадааст, шаҳодат медиҳад.
Таъсири ҳар як миопатияи немалинӣ бо ҳам хуб алоқаманд буд (r = 0.736) ва ҳамбастагии оқилона нишон доданд (Расми иловагии 11A–B), ки нишон медиҳад, ки миопатияи немалинии ACTA1 ва TNNT1 ба протеом таъсири монанд доранд. Аммо, баъзе сафедаҳо танҳо дар миопатияи немалинии ACTA1 ё TNNT1 танзим карда мешуданд (Расми иловагии 11A ва C). Протеини профибротикии MFAP4 яке аз сафедаҳои аз ҳама бештар танзимшаванда дар миопатияи немалинии TNNT1 буд, аммо дар миопатияи немалинии ACTA1 бетағйир монд. SKIC8, як ҷузъи комплекси PAF1C, ки барои танзими транскрипсияи гени HOX масъул аст, дар миопатияи немалинии TNNT1 пасттар буд, аммо дар миопатияи немалинии ACTA1 таъсир нарасонд (Расми иловагии 11A). Муқоисаи мустақими миопатияи немалинии ACTA1 ва TNNT1 коҳиши бештари сафедаҳои митохондрия ва афзоиши сафедаҳои системаи масуниятро дар миопатияи немалинии TNNT1 нишон дод (Расми 6G–H ва расмҳои иловагӣ 11C ва 11H–I). Ин маълумот бо атрофия/дистрофияи бештари мушоҳидашуда дар миопатияи немалинии TNNT1 дар муқоиса бо миопатияи немалинии TNNT1 (Расми 6A) мувофиқанд, ки нишон медиҳад, ки миопатияи немалинии TNNT1 шакли шадидтари бемориро ифода мекунад.
Барои арзёбии он, ки оё таъсири мушоҳидашудаи миопатияи немалинӣ дар тамоми сатҳи мушакҳо боқӣ мемонад, мо таҳлили протеомикии ҳаҷмии биопсияҳои мушакҳоро аз ҳамон як гурӯҳи беморони гирифтори миопатияи немалинии TNNT1 анҷом додем ва онҳоро бо гурӯҳи назоратӣ (n=3 дар як гурӯҳ) муқоиса кардем (Расми иловагии 13A, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 25). Тавре ки интизор мерафт, гурӯҳи назоратӣ дар таҳлили ҷузъҳои асосӣ бо ҳам зич алоқаманд буданд, дар ҳоле ки беморони миопатияи немалинии TNNT1 тағирёбии баланди байни намунаҳоро нишон доданд, ки ба он чизе монанд аст, ки дар таҳлили нахи ягона дида мешуд (Расми иловагии 13B). Таҳлили ҳаҷмии сафедаҳои ифодаёфтаи гуногун (Расми иловагии 13C, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 26) ва равандҳои биологиро (Расми иловагии 13D, Маҷмӯи маълумоти иловагӣ 27), ки бо муқоисаи нахҳои алоҳида нишон дода шудаанд, такрор кард, аммо қобилияти фарқ кардани намудҳои гуногуни нахҳоро аз даст дод ва таъсири бемориҳои гетерогениро дар байни нахҳо ба назар нагирифт.
Дар маҷмӯъ, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки протеомикаҳои якмиофабр метавонанд хусусиятҳои клиникии биологиро, ки бо усулҳои мақсаднок, ба монанди иммуноблоттинг, муайян карда намешаванд, равшан кунанд. Ғайр аз ин, ин маълумот маҳдудиятҳои истифодаи типикунонии нахи актин (MYH)-ро танҳо барои тавсифи мутобиқшавии фенотипӣ нишон медиҳанд. Дар ҳақиқат, гарчанде ки ивазкунии намуди нах байни миопатияҳои немалинии актин ва тропонин фарқ мекунад, ҳарду миопатияҳои немалин типикунонии нахи MYH-ро аз мубодилаи нахи мушакҳои скелетӣ ба сӯи протеоми мушакҳои зудтар ва камтар оксидшаванда ҷудо мекунанд.
Гетерогении ҳуҷайра барои қонеъ кардани талаботи гуногуни бофтаҳо муҳим аст. Дар мушакҳои скелетӣ, ин аксар вақт ҳамчун намудҳои нах тавсиф мешавад, ки бо дараҷаҳои гуногуни истеҳсоли қувва ва хастагӣ тавсиф мешаванд. Аммо, маълум аст, ки ин танҳо як қисми ночизи тағйирпазирии нахи мушакҳои скелетиро шарҳ медиҳад, ки нисбат ба он ки қаблан фикр карда мешуд, хеле тағйирёбанда, мураккаб ва бисёрҷанбатар аст. Пешрафтҳои технологӣ ҳоло ба омилҳои танзимкунандаи нахҳои мушакҳои скелетӣ равшанӣ андохтаанд. Дар ҳақиқат, маълумоти мо нишон медиҳад, ки нахҳои навъи 2X метавонанд зернамуди алоҳидаи нахи мушакҳои скелетӣ набошанд. Ғайр аз ин, мо сафедаҳои метаболикӣ, сафедаҳои рибосомӣ ва сафедаҳои бо ҳуҷайра алоқамандро ҳамчун муайянкунандагони асосии гетерогении нахи мушакҳои скелетӣ муайян кардем. Бо татбиқи ҷараёни кори протеомикии худ ба намунаҳои беморон бо миопатияи нематодӣ, мо минбаъд нишон додем, ки типи нахи MYH гетерогении мушакҳои скелетиро пурра инъикос намекунад, хусусан вақте ки система халалдор аст. Дар ҳақиқат, новобаста аз намуди нахи MYH, миопатияи нематодӣ боиси гузариш ба нахҳои тезтар ва камтар оксидшаванда мегардад.
Нахҳои мушакҳои скелетӣ аз асри 19 инҷониб тасниф карда мешаванд. Таҳлилҳои ахири омикс ба мо имкон доданд, ки профилҳои ифодаи намудҳои гуногуни нахҳои MYH ва вокунишҳои онҳоро ба ангезандаҳои гуногун дарк кунем. Тавре ки дар ин ҷо тавсиф шудааст, равишҳои омикс инчунин нисбат ба усулҳои анъанавии антителоҳо ҳассосияти бештар барои муайян кардани миқдори маркерҳои навъи нах доранд, бе он ки ба муайян кардани миқдори як (ё якчанд) маркер барои муайян кардани намуди нахи мушакҳои скелетӣ такя кунанд. Мо ҷараёнҳои кории транскриптомӣ ва протеомикии мукаммалро истифода бурдем ва натиҷаҳоро барои таҳқиқи танзими транскрипсия ва пас аз транскрипсияи гетерогении нахҳо дар нахҳои мушакҳои скелетии инсон муттаҳид кардем. Ин ҷараёни кор боиси нокомӣ дар муайян кардани нахҳои холиси навъи 2X дар сатҳи сафеда дар vastus lateralis-и когортаи мардони ҷавони солим гардид. Ин бо таҳқиқоти қаблии як нах мувофиқ аст, ки дар vastus lateralis-и солим <1% нахҳои холиси 2X-ро пайдо карданд, гарчанде ки ин бояд дар оянда дар дигар мушакҳо тасдиқ карда шавад. Тафовут байни ошкор кардани нахҳои қариб холиси 2X дар сатҳи mRNA ва танҳо нахҳои омехтаи 2A/2X дар сатҳи сафеда печида аст. Ифодаи изоформаи mRNA-и MYH сиркадианӣ нест,67 нишон медиҳад, ки мо эҳтимолан сигнали оғози MYH2-ро дар нахҳои зоҳиран 2X дар сатҳи RNA "аз даст додаем". Як тавзеҳи имконпазир, гарчанде ки комилан фарзӣ аст, метавонад фарқиятҳо дар устувории сафеда ва/ё mRNA байни изоформаҳои MYH бошад. Дар ҳақиқат, ҳеҷ як нахи зуд барои ягон изоформаи MYH 100% холис нест ва маълум нест, ки оё сатҳи ифодаи mRNA-и MYH1 дар диапазони 70-90% ба фаровонии баробари MYH1 ва MYH2 дар сатҳи сафеда оварда мерасонад. Аммо, ҳангоми баррасии тамоми транскриптом ё протеом, таҳлили кластерӣ метавонад бо итминон танҳо ду кластери алоҳидаро, ки нахҳои мушакҳои скелетии суст ва зудро ифода мекунанд, новобаста аз таркиби дақиқи MYH-и онҳо, муайян кунад. Ин бо таҳлилҳое, ки бо истифода аз усулҳои транскриптомии якҳастаӣ истифода мешаванд, мувофиқ аст, ки одатан танҳо ду кластери гуногуни мионуклеариро муайян мекунанд. 68, 69, 70 Ғайр аз ин, гарчанде ки таҳқиқоти қаблии протеомикӣ нахҳои навъи 2X-ро муайян кардаанд, ин нахҳо аз дигар нахҳои зуд ҷудо намешаванд ва дар муқоиса бо дигар намудҳои нахҳо, ки ба MYH асос ёфтаанд, танҳо шумораи ками сафедаҳои гуногунро нишон медиҳанд. 14 Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки мо бояд ба назари аввали асри 20 дар бораи таснифоти нахҳои мушакҳо баргардем, ки нахҳои мушакҳои скелетии инсонро на ба се синфи алоҳида, ки ба MYH асос ёфтаанд, балки ба ду кластер дар асоси хосиятҳои мубодилаи моддаҳо ва кашишхӯрии онҳо тақсим кардаанд. 63
Муҳимтар аз ҳама, гетерогении миофиберҳо бояд дар доираи андозаҳои гуногун баррасӣ карда шавад. Тадқиқотҳои қаблии "омика" ба ин самт ишора карда буданд ва нишон медиҳанд, ки нахҳои мушакҳои скелетӣ кластерҳои ҷудогона ташкил намедиҳанд, балки дар тӯли як континуум ҷойгир шудаанд. 11, 13, 14, 64, 71 Дар ин ҷо мо нишон медиҳем, ки илова бар фарқиятҳо дар хосиятҳои кашишхӯрӣ ва мубодилаи моддаҳои мушакҳои скелетӣ, миофиберҳоро бо хусусиятҳои марбут ба таъсири мутақобилаи ҳуҷайраҳо ва механизмҳои тарҷума фарқ кардан мумкин аст. Дар ҳақиқат, мо гетерогении рибосомаро дар нахҳои мушакҳои скелетӣ пайдо кардем, ки ба гетерогенӣ новобаста аз намудҳои нахҳои суст ва зуд мусоидат мекунад. Сабаби аслии ин гетерогении назарраси миофиберҳо, ки новобаста аз намуди нахҳои суст ва зуд аст, норавшан боқӣ мемонад, аммо он метавонад ба ташкили фазоии махсус дар дохили бофтаҳои мушакҳо, ки ба қувваҳо ва борҳои мушаххас оптималӣ посух медиҳанд,72 муоширати махсуси ҳуҷайравӣ ё узвҳои мушаххас бо дигар намудҳои ҳуҷайраҳо дар муҳити микромухити мушакҳо73,74,75 ё фарқиятҳо дар фаъолияти рибосома дар дохили миофиберҳои алоҳида ишора кунад. Дар ҳақиқат, гетероплазмияи рибосомӣ, хоҳ тавассути ивазкунии паралогии RPL3 ва RPL3L ё дар сатҳи 2′O-метилизатсияи rRNA, бо гипертрофияи мушакҳои скелетӣ алоқаманд буданаш нишон дода шудааст76,77. Истифодаи бисёрҷониба ва фазоӣ дар якҷоягӣ бо тавсифи функсионалии миофиберҳои инфиродӣ фаҳмиши моро дар бораи биологияи мушакҳо дар сатҳи бисёрҷониба боз ҳам беҳтар хоҳад кард78.
Бо таҳлили протеомҳои миофиберҳои ягона аз беморони гирифтори миопатияҳои немалинӣ, мо инчунин фоиданокӣ, самаранокӣ ва татбиқи протеомикаи миофиберҳои ягонаро барои равшан кардани патофизиологияи клиникии мушакҳои скелетӣ нишон додем. Ғайр аз ин, бо муқоисаи ҷараёни кори мо бо таҳлили протеомикии ҷаҳонӣ, мо тавонистем нишон диҳем, ки протеомикаи миофиберҳои ягона ҳамон умқи иттилоотро ба монанди протеомикаи бофтаи ҷаҳонӣ медиҳад ва ин умқро бо ба назар гирифтани гетерогении байни нахҳо ва намуди миофибер васеъ мекунад. Илова бар фарқиятҳои интизоршаванда (ҳарчанд тағйирёбанда) дар таносуби намуди нах, ки дар миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1 дар муқоиса бо назорати солим мушоҳида шудаанд,19, мо инчунин таҷдиди оксидшавӣ ва берун аз ҳуҷайраро новобаста аз иваз кардани намуди нах, ки тавассути MYH ба вуҷуд омадааст, мушоҳида кардем. Қаблан дар миопатияҳои немалинии TNNT1 фиброз гузориш шуда буд.19 Аммо, таҳлили мо бар ин бозёфт асос ёфтааст, ки инчунин сатҳи баланди сафедаҳои берун аз ҳуҷайраҳои ҷудошудаи марбут ба стресс, ба монанди аннексинҳо, ки дар механизмҳои таъмири сарколеммалӣ иштирок мекунанд, дар миофиберҳои беморони гирифтори миопатияҳои немалинии ACTA1 ва TNNT1 ошкор мекунад.57,58,59 Хулоса, сатҳи баланди аннексин дар миофиберҳо аз беморони гирифтори миопатияи немалин метавонад вокуниши ҳуҷайравӣ барои таъмири миофиберҳои шадиди атрофӣ бошад.
Гарчанде ки ин таҳқиқот бузургтарин таҳлили пурраи мушакҳои якнахдори инсон то имрӯз аст, он бе маҳдудият нест. Мо нахҳои мушакҳои скелетиро аз намунаи нисбатан хурд ва якхелаи иштирокчиён ва як мушаки ягона (vastus lateralis) ҷудо кардем. Аз ин рӯ, мавҷудияти популятсияҳои мушаххаси нахҳоро дар байни намудҳои мушакҳо ва дар ҳолатҳои шадиди физиологияи мушакҳо истисно кардан ғайриимкон аст. Масалан, мо наметавонем имконияти пайдоиши як зермаҷмӯи нахҳои ултратез (масалан, нахҳои холиси 2X)-ро дар спринтерҳои баландихтисос ва/ё варзишгарони қувват79 ё дар давраҳои ғайрифаъолияти мушакҳо66,80 истисно кунем. Ғайр аз ин, андозаи маҳдуди намунаи иштирокчиён моро аз таҳқиқи фарқиятҳои ҷинсӣ дар гетерогении нах бозмедошт, зеро маълум аст, ки таносуби намуди нах байни мардон ва занон фарқ мекунад. Ғайр аз ин, мо натавонистем таҳлилҳои транскриптомӣ ва протеомӣ дар ҳамон нахҳои мушакҳо ё намунаҳо аз ҳамон иштирокчиён гузаронем. Ҳангоме ки мо ва дигарон таҳлилҳои якҳуҷайра ва якмиофиберро бо истифода аз таҳлили омикс барои ноил шудан ба вуруди намунаҳои хеле паст (чунон ки дар ин ҷо дар таҳлили нахҳо аз беморони гирифтори миопатияи митохондрия нишон дода шудааст) беҳбуд мебахшем, имконияти якҷоя кардани равишҳои мултиомиксӣ (ва функсионалӣ) дар дохили нахҳои мушакии ягона равшан мегардад.
Умуман, маълумоти мо омилҳои транскрипсиявӣ ва пас аз транскрипсияи гетерогении мушакҳои скелетиро муайян ва шарҳ медиҳад. Хусусан, мо маълумотеро пешниҳод мекунем, ки як догмаи деринаро дар физиологияи мушакҳои скелетӣ, ки бо таърифи классикии намудҳои нах дар асоси MYH алоқаманд аст, зери суол мебаранд. Мо умедворем, ки баҳсро аз нав дида бароем ва дар ниҳоят фаҳмиши худро дар бораи тасниф ва гетерогении нахҳои мушакҳои скелетӣ аз нав дида бароем.
Чордаҳ иштирокчии қафқозӣ (12 мард ва 2 зан) ихтиёран розӣ шуданд, ки дар ин таҳқиқот иштирок кунанд. Тадқиқот аз ҷониби Кумитаи ахлоқии беморхонаи Донишгоҳи Гент (BC-10237) тасдиқ карда шуд, ба Эъломияи Ҳелсинкии соли 2013 мувофиқат кард ва дар ClinicalTrials.gov (NCT05131555) ба қайд гирифта шуд. Хусусиятҳои умумии иштирокчиён дар Ҷадвали Иловагии 1 оварда шудаанд. Пас аз гирифтани розигии шифоҳӣ ва хаттии огоҳона, иштирокчиён пеш аз дохил шудан ба таҳқиқот аз муоинаи тиббӣ гузаштанд. Иштирокчиён ҷавон (22-42 сола), солим (бе бемориҳои тиббӣ, надоштани таърихи тамокукашӣ) ва аз ҷиҳати ҷисмонӣ фаъоли миёна буданд. Ҳадди аксар истеъмоли оксиген бо истифода аз эргометри зина ба зина барои арзёбии фитнес, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, муайян карда шуд. 81
Намунаҳои биопсияи мушакҳо се маротиба дар ҳолати истироҳат ва дар ҳолати рӯзадорӣ, бо фосилаи 14 рӯз ҷамъоварӣ карда шуданд. Азбаски ин намунаҳо ҳамчун як қисми тадқиқоти калонтар ҷамъоварӣ карда шуданд, иштирокчиён 40 дақиқа пеш аз биопсия плацебо (лактоза), антагонисти ретсептори H1 (540 мг фексофенадин) ё антагонисти ретсептори H2 (40 мг фамотидин) истеъмол карданд. Мо қаблан нишон дода будем, ки ин антагонистҳои ретсептори гистамин ба фитнеси мушакҳои скелетӣ дар ҳолати истироҳат таъсир намерасонанд81 ва дар нақшаҳои назорати сифат мо ягон кластеризатсияи марбут ба ҳолат мушоҳида нашудааст (Расмҳои иловагӣ 3 ва 6). Парҳези стандартишуда (41,4 ккал/кг вазни бадан, 5,1 г/кг карбогидрат, 1,4 г/кг сафеда ва 1,6 г/кг равған) 48 соат пеш аз ҳар як рӯзи таҷрибавӣ нигоҳ дошта шуд ва субҳи рӯзи таҷрибавӣ наҳории стандартишуда (1,5 г/кг карбогидрат вазни бадан) истеъмол карда шуд. Таҳти наркози маҳаллӣ (0,5 мл 1% лидокаин бе эпинефрин), биопсияҳои мушакҳо аз мушакҳои вастус латералис бо истифода аз аспиратсияи Бергстрём тавассути пӯст гирифта шуданд.82 Намунаҳои мушакҳо фавран дар РНК ҷойгир карда шуданд ва то ҷудо кардани дастӣ нах (то 3 рӯз) дар ҳарорати 4°C нигоҳ дошта шуданд.
Бастаҳои навҷудошудаи миофиберҳо дар як косаи парвариш ба муҳити тару тозаи RNAlater интиқол дода шуданд. Сипас, миофиберҳои алоҳида бо истифода аз стереомикроскоп ва пинцетҳои борик дастӣ ҷудо карда шуданд. Аз ҳар як биопсия бисту панҷ нах ҷудо карда шуданд ва ба интихоби нахҳо аз минтақаҳои гуногуни биопсия диққати махсус дода шуд. Пас аз ҷудокунӣ, ҳар як нах ба 3 мкл буфери лизис (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), ки дорои ферментҳои протеиназа К ва DNase буд, ғӯтонида шуд, то сафедаҳо ва ДНК-и номатлубро хориҷ кунад. Сипас, лизиси ҳуҷайра ва хориҷ кардани сафеда/ДНК бо роҳи вортекскунии кӯтоҳ, чарх задани моеъ дар микроцентрифуга ва инкубатсия дар ҳарорати хонагӣ (10 дақиқа) оғоз ёфт. Сипас, лизат дар сиклери термикӣ (T100, Bio-Rad) дар 37°C барои 5 дақиқа, 75°C барои 5 дақиқа инкубатсия карда шуд ва сипас фавран дар -80°C то коркарди минбаъда нигоҳ дошта шуд.
Китобхонаҳои РНК-и полиаденилшудаи мувофиқ бо Illumina аз 2 µl лизати миофибер бо истифода аз маҷмӯаи омодасозии китобхонаи QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen) омода карда шуданд. Усулҳои муфассалро дар дастури истеҳсолкунанда пайдо кардан мумкин аст. Раванд бо синтези кДНК-и риштаи аввал тавассути транскрипсияи баръакс оғоз мешавад, ки дар он идентификаторҳои беназири молекулавӣ (UMI) ва штрих-кодҳои i1-и мушаххаси намуна ворид карда мешаванд, то ҷамъшавии намунаҳоро таъмин кунанд ва тағирёбии техникиро ҳангоми коркарди минбаъда коҳиш диҳанд. Сипас кДНК аз 96 миофибер ҷамъ карда мешавад ва бо муҳраҳои магнитӣ тоза карда мешавад, ки пас аз он РНК хориҷ карда мешавад ва синтези риштаи дуюм бо истифода аз праймерҳои тасодуфӣ анҷом дода мешавад. Китобхона бо муҳраҳои магнитӣ тоза карда мешавад, барчаспҳои i5/i7-и мушаххаси ҳавз илова карда мешаванд ва PCR тақвият дода мешавад. Қадами ниҳоии тозакунӣ китобхонаҳои мувофиқ бо Illumina-ро ба вуҷуд меорад. Сифати ҳар як маҷмӯаи китобхона бо истифода аз маҷмӯаи таҳлили ДНК-и хурди ҳассосияти баланд (Agilent Technologies, DNF-477-0500) арзёбӣ карда шуд.
Бар асоси миқдори Qubit, ҳавзҳо минбаъд дар консентратсияҳои эквимолярӣ (2 нМ) ҷамъ карда шуданд. Сипас, ҳавзи ҳосилшуда дар асбоби NovaSeq 6000 дар ҳолати стандартӣ бо истифода аз маҷмӯаи реагентҳои NovaSeq S2 (1 × 100 нуклеотидҳо) бо боркунии 2 нМ (4% PhiX) секвенсия карда шуд.
Лӯлаи мо ба лӯлаи таҳлили додаҳои QuantSeq Pool-и Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) асос ёфтааст. Маълумот аввал бо bcl2fastq2 (v2.20.0) дар асоси индекси i7/i5 демультиплекс карда шуданд. Сипас, хониши 2 бо idemux (v0.1.6) дар асоси штрих-коди намунавии i1 демультиплекс карда шуд ва пайдарпайиҳои UMI бо umi_tools (v1.0.1) истихроҷ карда шуданд. Сипас, хонишҳо бо cutadapt (v3.4) дар якчанд давр бурида шуданд, то хонишҳои кӯтоҳ (<20 дарозӣ) ё хонишҳое, ки танҳо аз пайдарпайиҳои адаптер иборат буданд, хориҷ карда шаванд. Сипас, хонишҳо бо истифода аз STAR (v2.6.0c) бо геноми инсон ҳамоҳанг карда шуданд ва файлҳои BAM бо SAMtools (v1.11) индексатсия карда шуданд. Хонишҳои такрорӣ бо истифода аз umi_tools (v1.0.1) тоза карда шуданд. Дар ниҳоят, ҳисобкунии ҳамоҳангсозӣ бо истифода аз featureCounts дар зернавис (v2.0.3) анҷом дода шуд. Назорати сифат бо истифода аз FastQC (v0.11.9) дар якчанд марҳилаҳои мобайнии лӯла анҷом дода шуд.
Ҳама коркард ва визуализатсияи минбаъдаи биоинформатика дар R (v4.2.3), асосан бо истифода аз ҷараёни кории Seurat (v4.4.0) анҷом дода шуданд. 83 Аз ин рӯ, арзишҳои инфиродии UMI ва матритсаҳои метамаълумот ба объектҳои Seurat табдил дода шуданд. Генҳое, ки дар камтар аз 30% ҳамаи нахҳо ифода ёфтаанд, хориҷ карда шуданд. Намунаҳои пастсифат дар асоси ҳадди ақали 1000 арзиши UMI ва 1000 гени ошкоршуда хориҷ карда шуданд. Дар ниҳоят, 925 нах аз ҳама марҳилаҳои филтркунии назорати сифат гузаштанд. Арзишҳои UMI бо истифода аз усули Seurat SCTransform v2 ба меъёр дароварда шуданд, 84 аз ҷумла ҳамаи 7418 хусусиятҳои ошкоршуда ва фарқиятҳои байни иштирокчиён аз байн бурда шуданд. Ҳама метамаълумоти дахлдорро дар Маҷмӯаи маълумоти иловагӣ 28 пайдо кардан мумкин аст.